#乙肝病*#
乙型肝炎（简称乙肝），是一种由乙型肝炎病*（hepatitisBvirus，HBV）感染引起的肝脏疾病，HBV慢性感染触发的疾病依然是全球性重大公共健康问题之一。目前，全球约2.4亿人感染HBV。每年由于HBV感染引发的死亡率大概是88万人，死亡率不亚于人类免疫缺陷综合征（HIV，俗称艾滋病）。目前，由于实行新生儿乙肝疫苗计划免疫，中国5岁以下儿童乙肝患病率较低，但尽管市场上已经存在有效的预防性疫苗，但对于已经长期感染了HBV的个体来说这种预防性疫苗发挥不了任何作用，乙肝治疗仍是医学界的长期难题，中国的HBV感染比例在世界范围内也处于较高水平。
RNA技术因为新冠疫情爆发横空出世为众人所熟知，成为目前生物医药领域中最热门的赛道之一。其实除了乙肝病*治疗外，基因编辑、CAR-T技术、肿瘤治疗等热门领域几乎都有结合mRNA技术的想象空间。而耀海生物作为一家生物制药中微生物表达体系的CDMO服务企业，以毕赤酵母和大肠杆菌表达体系承接上游端mRNA生产技术中的发酵和纯化阶段的业务。关于mRNA相关工艺技术我们之前也有过介绍，详见体外生成mRNA技术（IVT反应）之纯化篇、mRNA生产技术—5’端加帽（capping）反应原理，mRNA技术在传染病领域的应用也有所科普，详见mRNA技术在流感病*疫苗研发的应用。下面就详细看看如何利用RNA技术防治乙肝病*感染吧。
一、HBV的复制
HBV是一种小型的嗜肝包膜的部分双链DNA病*，基因组大小为3.2Kb。HBV病*颗粒（又称Dane颗粒），携带可插入包膜的3种类型的表面抗原（大抗原、中等抗原、小抗原）。该病*的核衣壳（Nucleocapsid）位于包膜内，二十面体结构，由核心蛋白的个二聚体组成，包封病*松弛的环形DNA（relaxedcircularDNA，rcDNA）和聚合酶。除了完整的具有感染性的病*颗粒外，HBV感染个体的血清里面还包含大量的亚病*颗粒，这些颗粒大部分由小型表面抗原蛋白组成。HBV病*通过表面蛋白S结构域上的抗原决定簇与肝脏细胞膜表面的低亲和力的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)结合形成复合物，致使HBV病*大表面蛋白L的Pre-S1能够特异性结合到高亲和力的胆汁酸转运蛋白(NTCP)上。接着HBV病*通过胞吞作用进胞内，从早期胞内体转移至晚期胞内体并脱去外壳蛋白。病*衣壳（HBVcapsids）沿着微管达到细胞核附近，通过核孔复合体进入宿主细胞核中。在核孔复合体的核篮中脱掉内壳蛋白，释放出病*基因组rcDNA到细胞核基质中。利用宿主细胞DNA修复酶rcDNA转变为共价闭合环状cccDNA，在被HBV感染的肝脏细胞中，cccDAN能够作为小型染色体稳定存在，充当病*RNA的转录模板。许多在肝脏细胞分布丰富的转录因子和核受体能够结合到HBV启动子和增强子元件上，在激活和调控HBV转录的过程发挥重要作用，转录过程受4个启动子(thecore、pre-S1、pre-S2/S、Xpromoters)和2个增强子的控制。借助宿主的转录系统在RNApolymerase2的介导之下，生成4组病*RNA：(1)3.5-kbpre-core(pre-C)mRNAandpgRNA，Pre-CmRNA编码生成HBeAg，pgRNA编码生成HBcAg和DNApolymerase，并同时充当病*DNA逆转录合成的模板。(2)2.4-kbmRNA，编码生成大表面蛋白；(3)2.1-kbmRNA，编码生成中表面蛋白和小表面蛋白；(4)0.7-kbmRNA，编码生成X蛋白。从cccDNA转录生成pgRNA的过程是HBV基因组扩增和复制的限速步骤，cccDNA很难被抗病*药物如核苷酸类似物清除，因此若想清除HBV病*就必须将cccDNA作为靶标，了解以cccDNA为模板的HBV的转录过程可以为抗病*治疗提供新的策略。
星耀小TIP：核受体是一类能与DNA应答元件(DNArespectiveelement)结合的配体激活性转录调控因子,它们的主要功能是特异性调控发育、生殖、代谢相关基因的表达。简单的描述是:配体自由通过质膜进入细胞，在胞质和或胞核内，与核受体结合成配体受体复合物,直接与DNA应答元件相互作用而调节靶基因的表达。
二、慢性HBV感染的治疗目标
临床上，乙肝主要通过乙肝五项指标进行诊断，包括：乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗体（抗-HBs）、乙肝е抗原（HBeAg）、乙肝е抗体（抗-HBe）以及乙肝核心抗体（抗-HBc）。其中，临床对HBsAg、HBeAg和抗-HBc三项阳性简称为"大三阳"，这提示体内病*复制比较活跃，传染性较强；HBsAg、抗-HBe和抗-HBc三项阳性则简称"小三阳"，表示病*复制活动及传染性较弱。"小三阳"和"大三阳"患者均可出现不同程度的消化系统症状，如恶心、*疸和出血等异常。目前临床上已开发出治疗HBV慢性感染的各种疗法，这些治疗方法的治疗目标可以分为HBV功能性治愈和完全治愈。HBV功能性治愈是指患者体内乙肝表面抗原（HBsAg）被清除掉，血清发生转化或不转化，但cccDNA仍持续存在。HBV完全治愈是指cccDNA完全被清除，患者体内所有存在的HBV元件均被清除干净，因此功能治疗被认为是HBV治疗策略的现实最终目标。
三、抗HBV药物研发现状
目前，获得美国食品和药品管理局批准的治疗慢性乙肝病*的药物有2种类型：一种是核苷/核苷酸类似物，另一种则是干扰素α（IFN-α）。核苷酸类似物是一种口服化学合成抗病*药物，分为嘌呤类和嘧啶类，其作用机制是与dNTP竞争性结合DNA聚合酶，从而抑制HBV的转录，但却无法清除cccDNA还容易产生耐药性。IFN-α可以提高抗病*免疫效应，抑制病*进入细胞，诱导cccDNA的部分降解，通过表观遗传修饰来抑制cccDNA转录，诱导病*RNA的降解，阻止蛋白质合成，抑制病*粒子分泌。然而，IFN-α的抗病*效果只能对少部分病人起作用，所以发展新型的直接作用于病*的药物和以宿主因子为靶标的药物也是迫切之势。
四、基于RNA技术的HBV药物防治策略
RNAi抗HBV药物RNAi抑制基因表达机制中心法则是遗传信息从DNA流转至RNA（转录过程），最后翻译成具有各种生理功能的蛋白质（翻译过程）。利用一定手段在可以在RNA水平沉默或下调靶标基因的表达。研究人员发现在哺乳动物细胞中存在一种类型的双链RNA片段，长度大概在20nt左右，可以降解靶标mRNA，阻断蛋白表达，因而称这类RNA为siRNA(smallinterferingRNAs)。外源合成的siRNA一旦进入宿主细胞，便会进入RNA诱导沉默复合物内(RNAinducedsilencing
