▋廖昊1,2，王杰2，鲁凤民2
1医院，深圳北京大学香港科技大学医学中心
2北京大学基础医学院病原生物学系暨感染病中心
1血清HBVRNA的存在形式和来源
年，德国学者Kck等在HBV感染者血清中首次发现HBVRNA的存在，后续相继开展了临床意义探索研究。
年，笔者团队和其他课题组先后系统地证实血清中的HBVRNA为未经或部分逆转录的、存在于核衣壳内的前基因组RNA（pgRNA），来自于感染肝细胞内共价闭合环状DNA（cccDNA）的转录。随后，其他研究团队也得出相似的研究结果。虽然关于血清中的HBVRNA是否主要存在于带有病*包膜的病*样颗粒内仍存不同观点，但均一致认为血清HBVRNA主要存在于病*核衣壳内，这一特性使其能相对稳定地存在于血液中。
慢性乙型肝炎（CHB）患者接受核苷（酸）类药物（NAs）治疗后，可有效阻断HBV松弛环状DNA（rcDNA）的合成，在短期内可导致循环血中未经或部分逆转录的pgRNA水平增加；但在长期的NAs治疗下，伴随着肝细胞内cccDNA减少，细胞内外的HBVRNA水平随之下降。HBVpgRNA存在不同长度的剪切变异体，但其存在的意义尚未完全阐明。NAs治疗除了可使异常的剪接变异体增加外，也可导致细胞内外出现大量pgRNA3′末端截短体，致使血清中的HBVRNA病*样颗粒复制缺陷，使其缺乏感染能力。
2影响血清HBVRNA水平的因素
一般而言，CHB患者血清中的HBVRNA低于HBVDNA水平。Butler等研究发现，HBsAg阳性的献血者中血清HBVRNA水平约为HBVDNA水平的1/。多项研究证实，处于不同自然史阶段的慢性HBV感染者其血清HBVRNA的水平存在明显差异。
Wang等将例慢性HBV感染者根据临床自然史分为4期：免疫耐受期HBVRNA水平最高，均值为6.78log10拷贝/ml，其次是免疫清除期5.73log10拷贝/ml，再活动期4.52log10拷贝/ml和低病*复制期2.96log10拷贝/ml。
vanCampenhout等检测了例慢性HBV感染者血清HBVRNA水平，这些患者的HBV基因型的分布分别为A基因型21%、B基因型10%、C基因型20%、D基因型46%和其他基因型3%。其中HBeAg阳性患者血清HBVRNA平均水平（6.5log10拷贝/ml）显著高于HBeAg阴性患者（4.1log10拷贝/ml），相对于D基因型而言，A、B和C基因型的HBVRNA水平较低。此外，该研究还发现低水平的HBVRNA与HBV基因组存在基本核心启动子突变或者前C区联合突变有关，并且血清HBVRNA水平与ALT水平呈正相关。
由此可见，血清HBVRNA的水平在不同疾病进展阶段的CHB患者中存在差异，在应用血清HBVRNA这一指标时应考虑以上影响因素，并与其他病*学指标和生化指标联合应用，以准确判断病*的复制情况和疾病进展。
3血清HBVRNA与其他的病*血清学指标的相关性
血清HBVRNA作为新的病*学指标，需要进一步了解其与传统指标间的关系，以利于其在临床实践中的应用。多项研究证实，血清中的HBVRNA与肝组织中的pgRNA高度相关，这在一定程度上也进一步证明了其来源于cccDNA的转录。此外，在不同基因型的HBV中，血清HBVRNA与血清HBVDNA、HBsAg和HBeAg均具有相关性。
笔者团队前期对84例非经治的慢性HBV感染者进行的研究也发现，血清HBVRNA水平分别与血清HBVDNA（r=0.，P＜0.）和HBsAg（r=0.，P＜0.）呈正相关。进一步将上述慢性HBV感染者分为HBeAg阳性和HBeAg阴性两组，在HBeAg阳性者中血清HBVRNA仍分别与血清HBVDNA（r=0.，P＜0.）和HBsAg（r=0.，P＜0.）呈正相关，但在HBeAg阴性者中，血清HBVRNA仅与血清HBVDNA呈正相关（r=0.，P＜0.），而与血清HBsAg无相关性（r=0.，P=0.）。由此可见，HBeAg阳性CHB患者血清HBVRNA与其他的病*血清学指标的相关性优于HBeAg阴性患者。
Butler等发现，在接受NAs治疗的CHB患者中，血清HBVRNA水平与HBVDNA水平的相关性较低。笔者的研究也发现CHB患者在接受NAs治疗后血清HBVDNA常常低于检测下限，而大部分患者血清HBVRNA仍可被检测，二者不存在相关性。并且，对于长期接受NAs治疗、HBsAg处于较低水平的CHB患者，血清HBVRNA水平与HBsAg定量相关性也逐渐消失，但血清HBVRNA与核心抗原相关抗原始终保持着较好的相关性。
需要强调的是，在接受PEG-IFN治疗的CHB患者中血清HBVRNA与HBVDNA在治疗过程中始终具有良好的相关性。
4血清HBVRNA可反映肝组织内cccDNA的活性或状态
HBVcccDNA的持续存在是导致HBV感染慢性化、CHB久治不愈和停药后容易复发的主要原因。因此，肝组织内cccDNA清除是判定HBV感染彻底治愈的一项重要指标。然而，临床上以cccDNA检测为目的的肝穿刺活组织检查难以普遍开展。因此，在无法直接精确检测肝组织内cccDNA及其活性的情况下，探索能够反映肝组织内cccDNA活性的替代血清学指标具有十分重要的意义。
Giersch等利用HBV感染的人肝嵌合小鼠进行的研究发现，血清HBVRNA水平与肝组织内cccDNA的水平呈正相关（r=0.89，P＜0.0）。笔者的研究进一步发现，在未经抗病*治疗的HBeAg阳性HBV感染者中血清HBVRNA水平与肝组织内cccDNA的水平具有相关性（r=0.39，P=0.），但这种定量相关性在HBeAg阴性HBV感染者中消失（r=0.10，P=0.）。
与Giersch等使用人源化小鼠模型的研究结果（r=0.89）相比，笔者的研究在HBeAg阳性HBV感染者分析得出的血清HBVRNA和肝内cccDNA的相关性相对较弱（r=0.39），这种差异可能与病*变异的积累和宿主遗传背景的多样性有关。
此外，Wang等研究发现未经抗病*治疗的CHB患者血清HBVRNA的水平不仅与肝组织中cccDNA的水平相关，而且与其转录活性（HBVRNA/cccDNA）具有显著的相关性。然而，笔者的前期研究发现，尽管CHB患者经NAs治疗后血清HBVRNA水平与肝组织内cccDNA的水平在定量关系上无相关性，但血清HBVRNA检测阳性与否仍可反映肝组织内cccDNA的状态，如在41例长期接受NAs治疗的CHB患者中，20例血清HBVRNA阳性的CHB患者其肝组织内cccDNA均阳性，9例肝组织内cccDNA低于检测下限的CHB患者中血清HBVRNA均低于检测下限，但在12例肝组织内cccDNA阳性的CHB患者血清中HBVRNA低于检测下限。该研究结果提示，在排除检测灵敏度的情况下，如果血清HBVRNA阳性则反映肝组织内存在cccDNA，并处于转录活跃状态；如果血清HBVRNA检测不到则反映肝组织内cccDNA消失，或者尽管其肝组织内cccDNA存在，但处于转录沉默状态。由此可见，在经NAs治疗的CHB患者中，虽然血清HBVRNA水平与肝组织内cccDNA的水平无相关性，但可反映肝组织内cccDNA的状态。
此外，笔者的前期研究还发现，反映HBVDNA聚合酶（p蛋白）逆转录活性的血清HBVRNA/HBVDNA比值在不同自然史的慢性HBV感染者中存在显著差异，据此认为，HBVDNA和HBVRNA的总体水平更能准确反映肝组织内cccDNA的水平及其转录活性。由于NAs不直接影响HBVRNA的生成，并且3.5kb的pgRNA仅能来自于cccDNA的转录，所以血清HBVRNA可作为反映肝组织内cccDNA活性或状态的替代血清学指标。
5血清HBVRNA可用于评价抗病*药物的疗效
已有多项研究证实血清HBVRNA可用于评价NAs抗病*治疗的疗效。Huang等通过分析52例接受拉米夫定或恩替卡韦治疗的CHB患者在治疗前、治疗12周和24周时的血清HBVRNA水平，发现在治疗12周时血清HBVRNA水平越低，CHB患者越容易在24周时实现HBVDNA阴转，表明血清HBVRNA水平可预测CHB患者经NAs治疗的病*学应答。
vanBmmel等通过分析50例接受NAs治疗的HBeAg阳性CHB患者，发现HBeAg阴转的患者中血清HBVRNA水平从基线至治疗3、6个月的下降幅度分别显著高于未发生HBeAg血清学转换的患者。同时，与血清HBVDNA、HBsAg、ALT、HBV基因型、年龄和性别相比，血清HBVRNA水平的下降幅度是预测HBeAg血清学转换的最佳血清学标志物。
同样，Luo等研究发现获得病*学应答的CHB患者在恩替卡韦治疗期间血清HBVRNA水平的下降幅度显著高于未获得病*学应答的患者，并且血清HBVRNA水平在治疗基线＜4.12log10拷贝/ml的CHB患者更容易发生HBeAg血清学转换。此外，监测血清HBVRNA水平还可预测经拉米夫定治疗的CHB患者出现病*耐药突变的风险。
此外，Wang等研究发现血清HBVRNA水平与肝脏炎症程度评分（r=0.，P＜0.）及纤维化程度评分（r=0.，P＜0.）均具有相关性，提示检测血清HBVRNA水平可预测CHB患者经NAs治疗后的肝组织学改善。
监测血清HBVRNA水平还可预测CHB患者PEG-IFN治疗的疗效。Jansen等研究发现NAs联合PEG-IFN治疗的CHB患者，其血清HBVRNA水平的下降幅度显著高于NAs单药治疗的患者，并且在HBeAg阴性CHB患者中基线时较低的血清HBVRNA水平与病*学应答独立相关。同样，vanBmmel等研究也发现CHB患者在接受PEG-IFN治疗过程中，其血清HBVRNA水平的动态变化可预测病*学应答的发生情况，对于预期应答不佳的患者应尽早更换抗病*方案，使患者获得最佳的治疗效果。
目前多家企业及科研单位正在开发针对HBV生命周期不同阶段的新型抗病*药物，包括病*与细胞受体结合抑制剂、新的病*聚合酶抑制剂、衣壳装配抑制剂、病*释放阻滞剂，以及cccDNA形成和转录抑制剂等。除了这些直接抗病*药物外，还在研发包括Toll样受体激动剂、检查点抑制剂和治疗性疫苗在内的增强抗HBV特异性免疫反应的药物。血清HBVRNA在目前的新药研发过程中已经成为评价药物抗病*疗效的一个重要血清学指标，并已写入美国食品药品管理局关于抗HBV新药申报的指导意见中。
6血清HBVRNA可预测NAs治疗停药后发生病*学反弹的风险
NAs主要通过抑制HBVDNA的合成发挥抗病*作用，患者的血清HBVDNA在用药后可很快低于检测下限。但此类药物对cccDNA并无直接作用，停药后易出现病*学反弹甚至疾病复发。因此，各国（地区）的CHB管理指南中均强调接受NAs治疗的CHB患者需要进行长期治疗，同时也对巩固治疗后的停药提出了建议。
Tsuge等通过小样本的回顾性临床研究发现停药点血清HBVRNA未检出的患者发生病*学反弹的风险明显下降。笔者在前期研究中也发现，21例停药点HBVRNA阳性的CHB患者在停药后24周全部出现病*反弹（%），而12例停药点HBVRNA低于检测下限的CHB患者中仅有3例（25%）出现病*反弹（P＜0.05），结果表明当血清中HBVRNA阳性时预示着停药后发生病*反弹和疾病复发的风险较高。
此外，笔者在32例接受PEG-IFN单独治疗或联合NAs治疗后实现血清HBsAg和HBVDNA均消失的CHB患者中发现，7例血清HBVRNA阳性的患者在停用PEG-IFN后均发生了HBsAg和（或）HBVDNA阳转，而在25例血清HBVRNA检测不到的患者中只有5例在停用PEG-IFN后发生了HBsAg和（或）HBVDNA阳转。这一结果表明，监测血清HBVRNA水平也可预测经抗病*治疗后实现HBsAg消失暨“临床治愈”的CHB患者出现病*反弹的风险。由于上述研究都是基于单中心的小样本回顾性队列研究，未来仍需多中心的大样本前瞻性研究加以验证。
7基于血清HBVRNA检测的CHB临床治愈精准路径
传统的病*学应答是基于血清HBVDNA水平定义的，然而，由于NAs治疗可直接高效阻断HBVrcDNA的生成，但并不直接影响pgRNA的生成，因此临床上会出现经NAs治疗的CHB患者中血清HBVDNA很快消失，而相当一部分患者的血清HBVRNA仍持续阳性的情况。血清HBVRNA阳性表明患者肝组织内仍存在转录活跃的cccDNA。为了更加准确的评估抗病*效果，笔者建议病*学应答的检测应该纳入血清HBVRNA的检测，并应重新定义为血清HBVDNA和HBVRNA均持续消失（低于检测下限）。
此外，笔者团队以HBVRNA检测为基础修订了“部分治愈”（partialcure）和“准临床治愈”（para-functionalcure）的概念；其中修订的“部分治愈”指的是CHB患者经抗病*治疗后ALT恢复正常，血清HBVDNA和HBVRNA持续低于检测下限，而此时的血清HBsAg水平仍较高；“准临床治愈”指的是在“部分治愈”的基础上肝组织内cccDNA已清除或处于持续的表达静默状态，但由于整合的病*DNA片段可以持续低水平表达HBsAg，患者血清HBsAg仍可有低值阳性。
以“准临床治愈”为基础，笔者对CHB的抗病*治疗提出了优化治疗路径的建议，其中建议对未达到“准临床治愈”的CHB患者继续进行NAs治疗或联合PEG-IFN治疗，达到“准临床治愈”后则可以考虑停止NAs用药，并进行PEG-IFN的序贯治疗，以期能够使更多的CHB患者实现临床治愈。通过CHB抗病*治疗阶梯式“治愈”的建议，期望有助于推动CHB临床治愈的精准治疗路径，最终有助于更多的CHB患者实现临床治愈。
随着血清HBVRNA的来源、性质，及其临床意义被逐渐阐明，该指标逐渐为大家所认识和重视，未来血清HBVRNA可能作为CHB患者经抗病*治疗实现血清HBVDNA消失后，反映抗病*疗效和肝组织内cccDNA活性或状态的补充指标。然而，目前国内乃至国际上尚无商品化的检测试剂。据悉国际诊断行业的一些著名公司已开展血清HBVRNA诊断试剂的研发，我国也应该加快相关试剂的研发和审批，使其早日应用于临床。